2019年8月1日，清华大学生命学院李雪明课题组及其合作者于《分析化学》 （analytical chemistry）在线发表题为《为传统电镜编写程序解析小分子和大分子的超高分辨率结构》 （programming conventional electron microscopes for solving ultrahigh-resolution structures of small and macro-molecules）的研究论文。该研究发布了一款新的microed数据收集软件etased，可以在传统的只配备单帧相机的200kv和120kv透射电子显微镜上将多肽和小分子结构解析至约0.6 a，并可以清楚的看到几乎所有氢原子的密度。该研究去除了microed对具有连续拍照模式的高端相机的依赖，证明了120kv低端电镜在microed中的可用性，大大降低了microed的设备成本，提高了该方法的普遍可用性，将有助于microed技术更加广泛的应用。
microed技术近年来被越来越广泛地用于解析蛋白和小分子的晶体结构，但目前所有研究组的microed数据收集都需要依赖具有连续拍照模式的高端相机，以使得在样品台连续旋转期间相机能够连续拍照，从而避免重构出的倒易空间三维点阵产生信息缺失，导致结构解析误差。然而除非特殊需要，具有连续拍照模式的高端相机一般并不会安装在相对低端的200kv或120kv电镜上，这就导致若要开展microed研究，就需要对硬件进行升级改造，额外的成本阻碍了microed技术的广泛应用。另外，根据电子显微镜的光学原理，电子衍射并不会像图像那样受到衬度传递函数（contrast transfer function，ctf）的分辨率约束，所以理论上低端的120kv电镜也可用于亚埃分辨率水平的电子衍射分析。然而，当前绝大多数microed研究都是使用配备场发射电子枪的200kv透射电镜做出的，120kv电镜的可用性也需要探索。
李雪明课题组的研究团队及其合作者开发了etased软件，通过软件来同步相机与样品台的行为，使得样品台仅在相机实际有效的曝光时间内旋转，其余时间保持静止以等待相机就绪，从而单帧相机收集的数据也能完整地覆盖倒易空间，而不产生信息缺失。研究团队使用菊池线这一平移不变的衍射花样作为标尺检测了实验条件下样品台旋转的稳定性，测试表明，软件所采用的样品台旋转方式具有较高的稳定性，且加速和减速过程极短，在相对较长的曝光时间下其影响可以忽略。借助etased软件，研究团队使用200kv fei f20电镜和120kv fei t12电镜将一个多肽的微晶样品分别解析至0.65 a和0.60 a，首次在大分子结构中清晰定位全部氢原子，并可以直接观察到晶体结构中复杂的氢键网络，对生物大分子的超高分辨率结构研究具有重要意义。此外，研究团队还将小分子化合物对乙酰氨基酚（acetaminophen）解析至0.65 a（f20）和0.83 a（t12），将生物素（biotin）解析至0.75 a（f20）和0.90 a（t12）。在0.65 a分辨率的对乙酰氨基酚结构中也可以直接看到几乎所有氢原子的密度。该研究降低了microed数据收集对硬件的要求，使得研究者可利用身边现有的硬件，仅通过软件途径即可低成本地收集高质量的microed数据，并解析超高分辨率结构，可推进microed技术在生命科学和药物化学领域更加广泛和深入的应用。
清华大学生命学院李雪明研究员和中科院上海有机化学研究所生物与化学交叉研究中心的刘聪研究员为本文的共同通讯作者，清华大学生命学院2015级博士生周珩、中科院有机化学研究所罗峰博士，清华大学生命学院罗智璞博士（现任苏州大学分子酶学研究所教授）为本文共同第一作者。
国家蛋白质科学中心（北京）清华大学冷冻电镜平台为本研究的样品制备和数据收集提供了支持。国家自然科学基金委、北京市结构生物学高精尖创新中心、清华-北大生命科学联合中心为本研究提供了经费支持。
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图1 通过样品台和相机软件协同控制方法获得衍射数据并解析超高分辨率结构的流程示意图。
