2018年1月9日，清华大学生命科学学院陈春来研究组在《cell reports》杂志发表了研究论文，题目为“the conformational dynamics of cas9 governing dna cleavage are revealed by single-molecule fret”（利用单分子fret揭示cas9在dna切割过程中的动态构象）。该论文展示了cas9可以自发地在三种主要构象中转换，揭示了cas9蛋白与pam远端dna/rna双链相互作用可长程别构调控cas9切割结构域的局部构象，这是cas9切割靶标dna之前的最后校验步骤。最后，该文提出了优化和设计高保真cas9的新思路，即通过突变cas9蛋白以影响这种长程别构调控机制，可提高cas9的识别特异性。
cirspr/cas9是一种可以由一条单链sgrna（single guide rna）指导的利用cas9核酸酶对靶向dna进行特异性识别和切割的技术。由于其可以高效快捷地靶向切割dna而被广泛地应用于基因编辑、基因表达调控、基因定位和成像等领域。但是，cas9的脱靶效应严重阻碍了其应用。尽管有一些研究报道了通过改造cas9和截短sgrna来提高其特异性，但仍然缺乏对cas9切割靶标dna的详细分子机制的全面认知，因而难以对cirspr/cas9的优化提供系统性的指导。
单分子荧光共振能量转移技术（fret）是检测生物大分子构象变化的有利工具。该研究通过在cas9蛋白的特异位点上标记荧光团，基于全内反射荧光显微镜快速灵敏地捕捉单个cas9分子的fret效率变化以及在每个fret状态的停留时间，以此反应cas9的构象变化，并提供该过程中的一系列动力学参数。该研究发现，cas9展现出三种构象状态，并可以自发的在这三种状态中自由切换。靶标序列的pam远端与sgrna的大于三个碱基的错配，导致cas9的hnh结构域（核酸切割结构域）稍偏离了其正确切割位点，因而将其从切割活性态转化为非活性状态。而这种对错配的校验机制是cas9蛋白与pam远端dna/rna双链相互作用对其hnh结构域的长程别构调控来实现的。
图1. cas9蛋白切割靶标dna的动态动态构象和校验机制模型
通过对cas9一些高保真突变体的研究，该文章证明了在cas9/rna/dna三聚复合物中引入额外的能量损耗导致cas9切割底物的能垒升高，从而提高了cas9切割特异性。该文章为优化cas9特异性提供了新思路，即通过减弱cas9与pam远端dna/rna异源双链的相互作用来提高切割能垒，从而达到提高特异性的目的。
清华大学生命科学学院陈春来研究员为本文通讯作者。清华大学生命学院cls项目三年级博士生杨梦铱，清华大学生命学院三年级直博生彭思佳为共同第一作者。本工作获得了北京结构生物学高精尖创新中心、清华-北大生命科学联合中心及国家自然科学基金委的经费支持。
原文链接
http://www.cell.com/cell-reports/fulltext/s2211-1247(17)31872-7
