2020年8月31日，清华大学生命科学学院方显杨课题组在《美国科学院院报》（pnas）发表了题为“基于拓宽遗传密码转录的长链rna位点特异性共价标记纳米颗粒技术”（site-specific covalent labeling of large rnas with nanoparticles empowered by expanded genetic alphabet transcription）的文章。
rna的结构-功能研究是结构生物学的前沿热点和难点。由于rna自身的柔性和分子量限制，应用传统的结构生物学方法，例如x射线晶体学、核磁共振或冷冻电镜对其进行结构研究非常困难。当前，rna的三维空间结构信息还非常少。为研究rna的结构，可通过向rna分子中位点特异性的引入一些探针或活性标记物（例如，金纳米颗粒， 顺磁探针， 荧光探针等），引入新的研究手段（例如，x射线散射干涉，电子顺磁共振，单分子荧光共振能量转移等），发展rna的整合结构生物学研究方案。
x射线散射干涉（x-ray scattering interferometry, xsi）是基于小角x射线散射技术（saxs）的一种新的分子标尺（molecular ruler）。通过向生物大分子位点特异性的标记上单个或成对的金纳米颗粒，通过saxs实验，可提供20-400埃范围内的位点特异性距离信息，因而在生物大分子的结构与动态特性研究中具有极大潜力。目前蛋白质和dna的位点特异性标记技术已有多种方案，而rna，特别是长链rna的位点特异性标记十分具有挑战性。当前， rna的位点特异性标记主要是通过固相化学合成实现的，这一方案通常对长度小于100个核苷酸的rna适用，因而，当前xsi的应用主要局限在短链rna。
为突破位点特异性标记rna分子量限制的瓶颈，推广xsi在长链rna结构研究中的应用，发展rna整合结构生物学方案，该文利用包含nam-tpt3非天然碱基核苷酸对的拓展遗传密码体系，通过化学合成碱基带有氨基修饰的tpt3（rtpt3a）（图1a），经过pcr和体外转录反应，在rna中位点特异性的引入tpt3a，进一步利用nhs-氨基化学反应的高选择性，通过与氨酰基修饰的金纳米颗粒反应，建立了长链rna位点特异性金纳米颗粒标记的策略（图1b）。
图1. 基于拓展遗传密码体系的长链rna位点特异性金纳米颗粒标记技术及其在x射线散射干涉中的应用。
登革病毒是重要的病原体，通过蚊虫叮咬在人类和其他动物中传播，对公共卫生健康产生极大威胁。登革热病毒是单股正链rna病毒，其基因组rna的线性-环化构象转换病毒的复制和致病性具有重要作用，对其机理进行研究有着重要意义。该文选择登革病毒的位于基因组rna3’非翻译区长度为97个核苷酸的3’sl元件和长度为719个核苷酸denv-mini rna元件，分别代表线性化和环化基因组rna，应用上述标记策略，成功实现了位点特异性的金纳米颗粒的标记， 并应用xsi测定了相关距离 （图1c）。xsi结果为领域内之前基于rna二级结构预测提出的线性-环化构象变化模型提供了重要的实验数据的支持。
清华大学生命学院方显杨研究员为本文的通讯作者。清华大学生命学院2016级ptn博士生王岩为本文的第一作者。清华大学生命学院2014级本科生陈垚宜（现在德国freie universität攻读博士学位）在项目的先期探索中做出了重要贡献，2017级cls博士生胡艳萍参与了部分工作。该项目受国家自然科学基金委大科学装置科学研究联合基金重点支持项目、北京结构生物学高精尖创新中心、清华-北大生命科学联合中心的经费支持。美国阿贡国家实验室先进光源12-id-b线站为小角x射线散射数据的收集提供了支持。
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生命学院供稿
