转录和复制是生物体维持和传递遗传信息的重要事件，它们以同一套基因组为模板，因而常会发生转录-复制对撞，诱发r-loop积累和dna断裂，导致基因组损伤。r-loop是由杂合双链rna:dna和单链dna组成的三链核酸结构，其过量积累会导致基因组不稳定，因此生物体进化出了一系列机制调控基因组内r-loop的水平。其中核糖核酸酶rnase h能够特异消化rna:dna杂合链中的rna，从而清除r-loop，维持基因组稳定。
2024年1月2日，清华大学生命学院孙前文实验室在《自然·通讯》(nature communications)杂志上发表了题为“引物酶促进转录和复制在同一模板链上的竞争从而导致dna损伤” (primase promotes the competition between transcription and replication on the same template strand resulting in dna damage)的研究论文。该研究揭示了拟南芥叶绿体dna复制引物酶促进叶绿体基因组的转录复制竞争和r-loop积累，从而诱发叶绿体基因组断裂的分子机制。
叶绿体是植物进行光合作用的场所，孙前文实验室前期鉴定了拟南芥基因组编码的三个rnase h1蛋白，并发现定位于叶绿体的atrnh1c蛋白可以与dna gyrase（拓扑异构酶）互作解除叶绿体基因组的转录复制对撞，清除r-loop，减少dna的损伤。atrnh1c突变体的叶绿体基因组内r-loop过量积累，高转录复制对撞区域dna断裂增多，从而引发叶片黄化，植物矮小的表型（yang et al., the plant cell 2017）。
为进一步探究参与基因组稳定性和r-loop调控的新因子，孙前文实验室对atrnh1c突变体进行ems诱变筛选，获得多个表型抑制突变体。其中acs1（atrnh1c suppressor 1）突变体无论是叶片颜色，光合效率，以及叶绿体的数目和形态，与atrnh1c相比均有显著恢复（图1a和b）。通过基因定位和功能验证鉴定到acs1基因编码一个叶绿体和线粒体双向定位的引物酶ath（图1c-f）。引物酶在dna复制过程中合成小的rna片段，引导合成新的dna链。
图1 叶绿体引物酶ath点突变通过减弱其与dna结合抑制atrnh1c突变体表型
在acs1突变体中，ath蛋白的一个跨物种间高度保守的氨基酸发生替换，导致蛋白与dna模板的结合能力变弱，合成rna引物以及介导dna复制酶合成dna的能力下降，从而减缓了转录-复制对撞和r-loop积累，使得atrnh1c突变体的表型缺陷发生一定程度的恢复（图2a-c）。通过链特异性的dna断裂测序发现，在叶绿体基因组中高转录复制对撞的rdna区域，转录和后随链的复制在同一条dna链上进行，这条链的转录本末端存在特异且较高程度的单链dna断裂（图2d和e）。通过构建叶绿体dna复制酶pol1a与atrnh1c的双突材料1cpol1a，进一步验证了减缓复制可以减轻转录-复制对撞和r-loop积累，从而维持基因组稳定，恢复atrnh1c突变表型。
图2 ath点突变减少叶绿体基因组r-loop积累和转录-复制冲突
此外，作者发现超表达引物酶ath会促进叶绿体基因组中r-loop过量积累，诱发dna断裂，并引起植株产生新叶黄化的表型（图3 a和b）；而通过基因编辑敲除ath则会导致胚胎致死，胚胎发育停滞在球形胚期（图3 c-f）。这些结果表明细胞器中的引物酶ath对于拟南芥的正常生长发育不可或缺。
图3 适当的ath表达对于植物正常生长发育具有重要意义
综上，本研究通过筛选拟南芥叶绿体中高度积累r-loop的atrnh1c突变体的回复突变，揭示了引物酶在调控基因组转录复制对撞中的作用，对于研究其他物种中的r-loop和基因组稳定性的调控机制具有借鉴意义。同时，本研究也证实了拟南芥细胞器引物酶ath的适当表达水平对于植物的生长发育的重要性。
清华大学生命科学学院博士后张卫峰为该论文第一作者，孙前文副教授为本文通讯作者，孙前文实验室2016级已毕业博士生杨卓和已出站博士后王文杰也参与了该项研究。该工作得到国家自然科学基金、清华-北大生命科学联合中心、中国博士后科学基金等经费的支持。
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